اندازه گیری ویتامین E (آلفا توکوفرول)

تهیه محلول ها:

1- پیرو کاتکول: یک گرم از ماده در پنج میلی لیتر متانول با درجه خلوص HPLC حل شد. سپس در دمای چهار درجه سانتی گراد نگهداری گردید.

2- هیدروکسید پتاسیم (5/0 مولار): میزان 01/7 گرم KOH را با متانول(با درجه خلوص HPLC) به حجم 250 میلی لیتر رسانده شد. متانول و استونیتریل مربوط به فاز متحرک با درجه HPLC بودند.

استخراج:

1- نمونه برگی که قبلا خشک شده بود را آسیاب نموده و از غربال با مش 8 عبور داده شد. نمونه برگ قبلادر دمای 50 درجه سانتی گراد به مدت 48 ساعت خشک شده بود . 1/0 گرم از نمونه های گیاهی خشک در شرایط بدون نور در فالکن 15 میلی لیترریخته شد . دور فالکن توسط فویل آلومینیمی برای جلوگیری از نفوذ نور پوشیده گردید .

2- مقدار ۲۰۰ میکرولیتر محلول پیروکاتکول و 5 میلی لیتر محلول هیدرواکسید پتاسیم   (۵/۰مولار در متانول) به نمونه اضافه شده و سریعا به مدت 20 ثانیه ورتکس شد. سپس نمونه ها به مدت 15 دقیقه در حمام آب داغ با دمای 80 درجه سانتی گراد قرار داده شدند. در طول این مدت نمونه ها هر 5 دقیقه یکبار برداشته و ورتکس گردیدند.

3- پس از قرار گرفتن در حمام آب یخ ، 1 میلی لیتر آب مقطر و 5 میلی لیتر هگزان اضافه شده و به سرعت به مدت یک دقیقه ورتکس  و پس از آن به مدت 2 دقیقه درg 373 سانتریفوژ گردید.

4 – میزان 3 میلی لیتر از محلول رویی را به لوله آزمایش دیگری منتقل کرده و در فریز درایر خشک گردید.

5- باقی مانده را در 5/1 میلی لیتر فاز متحرک متانول – استونیتریل (v/v 50:50 ) حل نموده و سپس با فیلتر دارای منافذ 5/0 میکرومتر فیلتر شد.

6- در پایان ۲۰ میکرولیتر از نمونه، به دستگاه HPLC با ستون C₁₈ تزریق شد. قبل از تزریق می توان نمونه ها را در  10 -   درجه سانتی گراد نگهداری کرد.

 

 

استاندارد ها:

قبل از تزریق نمونه ها به دستگاه HPLC  ، استاندارد های 5/0 ، 75/0 ، 5/1 ، 3 و 5/4  پی پی ام                   a-tocopherol  تزریق گردید (31).

شرایط آنالیز HPLC:

-         دتکتور :  فلئورسانس

-         فاز متحرک : متانول – استونیتریل (v/v 50:50 )

-         شدت جریان : 3/1 میلی لیتر در دقیقه

-         طول موج برانگیختگی : 288 نانومتر ، طول موج نشر : 329 نانومتر

-         دمای آزمایش : دمای محیط

منبع:

حسیبی، پ. 1386. بررسی فیزیولوژیکی اثر تنش سرما در مرحله­ی گیاهچه­ای ژنوتیپ­های مختلف برنج. رساله دکتری دانشگاه شهید چمران اهواز. ص.145.