زمانی که برای تفسیر نتایج آزمایش های مربوط به تاثیر تنش در گیاهان نیاز مبرم به در اختیار داشتن داده های فسفات غیر آلی (معدنی) داشتم توانستم با صرف ساعتها وقت در آزمایشگاه  پژوهشکده بیوتکنولوژی و البته راهنمایی های ارزنده استاد گرانقدرم دکتر فوآد مرادی، با تلفیق چند پروتکل در زمینه سنجش فسفر، که بیشتر کل فسفر را اعم از آلی و معدنی اندازه گیری می کردند،برای نخستین بار در کشور این سنجش را انجام دهم. لذا این را مانند بسیاری دیگر پروتکل های وبلاگم با نام روش تغییر داده شده نام گذاری کرده ام. تا کنون دوستان زیادی اعم از اساتید دانشگاه و دانشجویان دکتری با مراجعه به رساله دکتری من از آن استفاده کرده اند و از طریق ایمیل سوالاتشان را پرسیده اند. لذا برای استفاده همگان با رضایت کامل آن را در اختیار علاقمندان می گذارم.

                                                                                                                                 پیمان حسیبی

 تهیه محلول ها:

1-    اسید نیترک 65 درصد : ۱۴/۴ مول اسید نیتریک  در 1 لیتر آب مقطر حل گردید.

2-    محلول آمونیم مولیبدات: مقدار ۵/۶۲۵ گرم آمونیم هپتا مولیبدات در ۱۰۰ میلی لیتر آب مقطر گرم حل شد.

3-    محلول آمونیم وانادات: مقدار ۰/۳۱۲۵ گرم آمونیم وانادات در ۷۵ میلی لیتر آب مقطر جوش حل گردید.

4-    محلول آمونیم وانادات را به محلول آمونیم مولیبدات اضافه کرده و بعد از خنک شدن ۶۲/۵ میلی لیتراز محلول 1 ( اسید نیتریک غلیظ) را به آن اضافه کرده و با آب مقطر حجم کل را به ۲۵۰ میلی لیتر رسانیده شد.

5-    اسید کلریدریک (HCL ) با نرمالیته ۰/۰۱: مقدار ۱ میلی لیتر از اسید کلرید ریک ۳۷%  با آب مقطر به حجم ۱۰۰۰ میلی لیتر رسانیده شد.

 تهیه استاندارد ها:

1- استاندارد ۵۰۰ میلی گرم در لیتر فسفر: مقدار ۰/۱۱ گرم از KH2PO4 را در آب مقطر حل کرده و به حجم ۵۰ میلی لیتر رسانیده شد. محلول حاصل در ظرف پلی اتیلن نگهداری گردید.

2- استاندارد ۵۰ میلی گرم در لیتر فسفر: مقدار ۱۰میلی لیتر از محلول استاندارد ۵۰۰ میلی گرم در لیتر  به بالن ژوژه ۱۰۰ میلی لیتر منتقل و به حجم ۱۰۰ میلی لیتر رسانیده شد. این محلول در ظرف پلی اتیلن نگهداری شد.

3- تهیه استاندارد های صفر ، 4 ، 8 ، 12 ، 16 و 20 میلی گرم در لیتر فسفر : مقدار  صفر ، 4 ، 8 ، 12 ، 16 و 20 میلی لیتر از محلول استاندارد 50 میلی گرم در لیتر را به لوله آزمایش یا فالکون 50 میلی لیتر  منتقل و سپس 10 میلی لیتر از محلول آمونیم مولیبدات- وانادات را به آن اضافه کرده و با آب مقطر به حجم 50 میلی لیتر رسانیده شد. این محلول ها حاوی صفر ، 4 ، 8 ، 12 ، 16 و 20 میلی گرم در لیتر فسفر بودند که برای رسم منحنی کالیبراسیون در زمان قرائت نمونه ها با اسپکتروفتومتر استفاده گردیدند.

استخراج به وسیله هموژناسیون :

1-    مقدار ۰/۵ گرم بافت تازه گیاهی را تحت نیتروژن مایع با استفاده از هاون چینی خرد نموده و در فالکون 50 میلی لیتری ریخته شد.

2-    برای استخراج یون های غیر آلی توسط هموژناسیون ، میزان 5 میلی لیتر از HCL با نرمالیته ۰/۰۱  به فالکون ها اضافه گردید.

3-    نمونه ها توسط دستگاه هموژنایزر در دور 20000 ، برای مدت 90 ثانیه هموژنیزه شدند.

4-    عصاره حاصله با استفاده از فیلتر با قطر منافذ 45 میکرو متر قبل از آزمایش فیلتر شدند.

5-    عصاره فیلتر شده در ویال 2 میلی لیتری ریخته شد.

6-    میزان 2 میلی لیتر از عصاره را به فالکن 15 میلی لیتر منتقل و سپس 2 میلی لیتر از محلول آمونیم مولیبدات- وانادات به آن اضافه کرده ، با آب مقطر به حجم 15 میلی لیتر رسانیده شد.

با استفاده از دستگاه اسپکترو فتومتر UV-VISIBLE در طول موج 470 نانومتر ، مقدارجذب نمونه ها قرائت گردید :

برای محاسبه داده ها یک تناسب می بندیم مثلا 31000 میلی گرم اگر 1000 میلی مولار باشد پس 12 میلی گرم (عدد حاصل از اسپکتروفتومتر) چقدر است که میشود ۰/۳۸۷ سپس این عدد را باید در عدد هزار ضرب نمایید که میشود ۳۸۷ میکرومول در لیتر.

البته عدد نهایی را باید ضربدر 4 نمایید و سپس ضربدر تعداد رقیق کردن نمایید. ضربدر 4 برای این است که وزن نمونه 0.25 بوده البته اگر وزن نمونه نیم گرم بوده ضربدر 2 بکنید نمونه را رقیق نکرده اید که نیازی به ضرب در مقدار رقیق کردن نیست  (روش تغییر داده شده مینوچا و همکاران).

منبع:

حسیبی، پ. 1386. بررسی فیزیولوژیکی اثر تنش سرما در مرحله­ی گیاهچه­ای ژنوتیپ­های مختلف برنج. رساله دکتری دانشگاه شهید چمران اهواز. ص.145.