دکتر پیمان حسیبی

طرز تهیه محلول­‎ها:

1-  محلول سولفات روی 5% : 5 گرم سولفات روی در آب مقطر حل، و به حجم 100 میلی لیتر رسانده شد.

2- محلول هیدروکسید باریم 3% نرمال: 725/4 گرم پودر هیدروکسید باریم را در آب مقطر حل، و به حجم 100 میلی‎لیتر رسانده شد.

3- محلول 5% فنل: 5 گرم پودر فنل را در آب مقطر حل، و به حجم 100 میلی‎لیتر رسانده شد.

4- محلول الکل اتیلیک 80%

روش انجام آزمایش:

1- نمونه برگی خشک شده در آون، از الك با مش 8 عبور داده شد.

2- 1/0 گرم از نمونه آسیاب شده وزن و درون فالکون ريخته شد.

3- مقدار 15 میلی‎لیتر اتانول 80% که قبلا آن را گرم نموديم به ارلن اضافه کرده و به مدت 20 ثانیه ورتکس شد.

4- نمونه­ها در دستگاه سانتریفیوژ به مدت 10 دقیقه با سرعت 3000 دور در دقیقه سانتریفیوژ گردیدند.

تذکر1: به جای سانتریفیوژ می­توان با استفاده از قیف و کاغذ صافی نمونه­ها را در فالکون 50 میلی‎لیتری صاف نمود و 5 مرتبه آن را با 5 میلی‎لیتر اتانول شستشو و حجم آن را به 40 میلی‎لیتر رساند.

تذکر2:فاز مایع جدا شده برای اندازه­گیری قند و بخش جامد باقی­مانده برای اندازه­گیری نشاسته نگه­داري شدند.

5- فالکون­‎های حاوی عصاره به مدت 24 ساعت در آون با دمای50 درجه سانتی‎گراد نگه­داري شدند تا اتانول آن­ها تبخیر شود.

تذکر: در صورت کمبود وقت می­توان عصاره­های درون فالکون را درون پتری‎دیش ریخته و به مدت 1 ساعت در دمای 50 درجه سانتی­گراد قرار دهیم.

6- پس از تبخیر الکل، فقط جرم زرد رنگ یا سفید رنگی در کف پتری­‎ها باقی­ماند، كه با 40 میلی‎لیتر آب مقطر شستشو داده و درون فالکون 50 ميلي ليتر ريخته شد.

7- به منظور حذف رسوبات اضافی و ترکیبات دیگر، مقدار 5 میلی‎لیتر از محلول 5% سولفات روی و 7/4 میلی‎لیتر از محلول هیدروکسید باریم ۳/۰ نرمال را کاملاً ورتکس کرده و به فالکون­‎ها اضافه شد.

8- فالکون­ها به مدت 10 دقیقه با سرعت 3000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند.

9- مقدار 2 میلی‎لیتر از عصاره فاز مایع بعد از سانتریفیوژ به فالکون 15 ميلي ليترمنتقل شد.

10- به هر لوله آزمایش 1 میلی‎لیتر محلول 5% فنل اضافه نموده، سپس به شدت تکان داده تا کف در آن ظاهر شد.

11- بوسیله پاپیتور مقدار 5 میلی‎لیتر اسید سولفوریک 98% به داخل هر یک از نمونه­ها اضافه شد.

تذکر1: مرحله 10 و 11 حتماً باید زیر هود انجام گیرد.

تذکر2: برای تهیه شاهد، 1 میلی‎لیتر فنل و سپس 5 میلی‎لیتر اسید سولفوریک 98% در یک فالکون ريخته شد.

12- پس از آماده­سازی محلول­‎ها 45 دقیقه صبر نمودیم تا رنگ محلول­ها تثبیت گردد. سپس نمونه­ها با دستگاه اسپکتروفتومتر (با استفاده از نور عبوری) با طول موج 485 نانومتر قرائت شدند.

13- استاندارد­های قند محلول در کووت دستگاه اسپکتروفتومتر ریخته و مقدار قند در طول موج  485 نانومتر قرائت، و منحنی استاندارد رسم شد. سپس میزان جذب در نمونه­های گیاهی را قرائت نموده و با قرار دادن در معادله خط مقدار قند بدست آمد.

روش تهیه استاندارد ها:

برای تهیه استاندارد های 20 ، 40 ، 60  و 80 پی پی ام گلوکز،  مقدار 2 میلی لیتر از استوک استاندارد ها را برداشته و مراحل 10 و 11 بر روی آن انجام داده شد. برای بلانک از 1 میلی لیتر فنل 5%  و 5 میلی لیتر اسید سولفوریک 98%  استفاده گردید .

برای تهیه استوک استاندارد ها ابتدا محلول 1000 پی پی ام گلوکز را تهیه کرده و سپس برای استاندارد های 20 ، 40 ، 60 و 80 پی پی ام به ترتیب مقدار 1 ، 2 ، 3 و 4 میلی لیتر از محلول 1000 پی پی ام  برداشته ودر بالن ژوژه 50 میلی لیتری حجم آن را با آب مقطر به 50 میلی لیتر رسانیده شد . سپس با استفاده از دستگاه اسپکترو فتومتر ، مقدار جذب را مشخص کرده و منحنی استاندارد رسم گردید.

منابع:

حسیبی، پ. 1386. بررسی فیزیولوژیکی اثر تنش سرما در مرحله­ی گیاهچه­ای ژنوتیپ­های مختلف برنج. رساله دکتری دانشگاه شهید چمران اهواز. ص.145.

Sheligl, H. Q. 1986. Die verwertung orgngischer souren durch chlorella lincht. Planta Journal, 47-51.