دکتر پیمان حسیبی

به نظر من استخراج و خالص سازی هورمون ها یکی از سخت ترین، زمان بر ترین و در عین حال جذاب ترین آزمایش های فیزیولوژیک محسوب می شود. به یاد می آورم زمانی که در پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی کرج به اتفاق دوست عزیزم آقای دکتر محسن سعیدی کار بر روی هورمون ها را شروع کردیم روزها و هفته ها نتوانستیم آزمایشگاه را ترک کنیم، شاید برایتان عجیب باشد ولی عین واقعیت است! ضمن تشکر فراوان از استاد بزرگوارم جناب آقای دکتر فواد مرادی عضو محترم هیات علمی پژوهشکده و همچنین سرکار خانم مهندس مهشید رحیمی فرد، در زیر پروتکل اپتیمایز شده هورمون ها را می آورم.

آماده سازي محلول ها:

1.       محلول استخراج: 25/0 گرمButylated hydroxytoluen  و 5/0 گرم Sodium ascorbate (يا 44/0 گرم (Ascorbic acid در متانول 90%  با درجه HPLC حل گردیده و به حجم يك ليتر رسانيده شد.

2. بافر فسفات 5/0 مولار: 8 گرم NaCl، 2/0 گرمKH₂PO₄  و 6/9 گرم Na₂HPO₄.12H₂O در آب مقطر حل شده و به حجم يك ليتر رسید.
3. پتاس 2/0 نرمال: 122/1 گرمKOH  را در آب مقطر حل کرده و به حجم صد ميلي­ليتر رسانيده شد.
4. هيدروكلريك اسيد 2/0 نرمال: 66/1 ميلي ليتر HCl 37% با دانسيته Kg/L ۱/۱۹ را به آب مقطر افزوده و سپس به حجم صد ميلي­­ليتر رسانیده شد.
5. متانول

روش كار:

1.       2 گرم از ماده گياهي تازه برداشته و با اضافه كردن  ml ۴۰ محلول استخراج در هاون چيني خرد گردید.

2.       نمونه­هاي خرد شده در تاريكي و دماي^oC  ۴به مدت حداقل 16 ساعت نگهداري شد تا عمل انحلال هورمون­ها به خوبي صورت گيرد.

3. نمونه­هاي خرد شده راتوسط كاغذ صافي واتمن شماره 1 فيلتر نموده و بافت­هاي باقيمانده بر روي فيلتر سه بار توسط محلول استخراج شستشو گردید.
4. متانول اضافي را توسط دستگاه  Freeze Dryer در دماي ^oC -۳۵ تبخير کرده و سپس هم حجم محلول باقيمانده، بافر فسفات   5/0 مولار اضافه شد. سپس با اضافه كردن پتاس 2/0 نرمالpH  محلول به 5/8 رسانيده شد.
5. به محلول بدست آمده به ميزان برابر اتيل­استات اضافه شد تا بخشي از ناخالصي­ها در آن حل شود. در اين مرحله محلول دو فازي گردید. اين محلول را ورتكس کرده و فاز بالايي (اتيل­استات) را دور ریخته شد و باقيمانده اتيل­استات توسط دستگاه Freeze Dryer در دماي ^oC -۳۵ تبخير شد.
6. pH بخش آبكي را توسط هيدروكلريك اسيد 2/0 نرمال به حدود 5/2 رسانده و دوباره به ميزان برابر   اتيل­استات اضافه گردید، با اين تفاوت كه اين بار فاز اتيل­استات نگه داشته ­شد.
7. فاز اتيل­استات اسيدي را توسط دستگاه  Freeze Dryer در دماي ^oC -۳۵ خشك شده بود و باقيمانده بلافاصله در    ml ۰/۵  متانول حل نموده شد.
8. نمونه را از فيلتر پلي­تترافلوئورواتيلن 45/0 عبور داده و سپس به ستون HPLC تزريق گردید.
9. اجزاي محلول بدست آمده توسط دستگاه HPLC با ستون C₁₈،  شدت جريان ml/min ۰/۷ و حلال  استيك­اسيد 2/0% و متانول 100% به نسبت 50 :50  در دماي ^oC ۴۰ جدا گردیدند.

 شرایط آنالیز با HPLC :

دتکتور : UV

فاز متحرک : استیک اسید 2/0 درصد و متانول 100% (v/v 50:50 )

دمای ستون : 40 درجه سانتی گراد

نوع ستون : C₁₈

شدت جریان : 7/0میلی لیتر در دقیقه

منبع:

حسیبی، پ. 1386. بررسی فیزیولوژیکی اثر تنش سرما در مرحله­ی گیاهچه­ای ژنوتیپ­های مختلف برنج. رساله دکتری دانشگاه شهید چمران اهواز. ص.145.

سنجش هورمونهای گیاهی بوسیله دستگاه HPLC (عکس از پیمان حسیبی)

ست فیلتر میلی پور HPLC متصل به پمپ خلاء (عکس از پیمان حسیبی)

کاتریج سر سرنگی برای فیلتر کردن عصاره قبل از تزریق به دستگاه HPLC (عکس از پیمان حسیبی)

Cold Room که تمام مراحل استخراج و آماده سازی نمونه های هورمون باید در آن انجام شود (عکس از پیمان حسیبی)

دستگاه Rotary Evaporator برای خالص سازی حلال های مورد استفاده به ویژه متانول و اتیل استات (عکس از پیمان حسیبی)

دستگاه Freeze Dryer (عکس از پیمان حسیبی)

انواع دسیکاتور که در صورت نیاز به تغلیظ نمونه های دارای حجم کم می توان از آن به صورت متصل به پمپ خلاء استفاده کرد (عکس از پیمان حسیبی)