آماده­سازي واكنشگرها:

  1. ۵۰۰ میلی لیتر از محلول پتاسيم فسفات يك مولار (7 = pH) به عنوان محلول استوك براي رقيق كردن در ساخت بافر فسفات mM 50  به كار مي­رود. مقدار ml 500 از دو محلول يك مولار KH2PO4  (با pH اسيدي) و يك مولار K2HPO4  (با pH بازي) را به طور جداگانه تهيه شد. سپس در حالي كه محلول K2HPO4 در pH متر همزده مي­شود به آرامي به آن KH2PO4 اضافه كنيد تا pH به 7 برسد.
  2. يك ليتر محلول نیم درصد ( w/v) اسيد تيوباربيتیوريك (thiobarbituric acid) حاوي اسيد تري­كلرو استيك w/v) 20%) دقيقاً 5 گرم از اسيد تيوباربيتیوريك و 200 گرم اسيد تري­كلرواستيك را در  700 میلی لیتر آب مقطر مخلوط نموده و يك شب مانده (در سردخانه با دمای ۴ درجه سانتی گراد)، روز بعد با اضافه كردن آب مقطر محلول به حجم یک لیتر رسانيده می شود.

روش كار:

1.  مقدار 5/0 گرم از نمونه برگ تازه با نيتروژن مايع براي مدت يك دقيقه در هاون خرد نموده شد.

2.  پودر برگ خرد شده را درون لوله آزمايش ريخته، سپس  ۵ میلی لیتر بافر پتاسيم­فسفات  ۵۰  میلی مولار  (7=pH) كه در درون ظرف يخ قرار دارد به آن اضافه گردید.

3.  نمونه حاصله در دماي C° 4 به مدت 30 دقيقه با دور rpm 14000 سانتريفوژ شد.

4. به ml 1 از محلول بالايي پس از سانتريفوژ ml  1 محلول  w/v) ٪ ./ ۵)  اسيد تيوباربيتیوريك (thiobarbituric acid) كه حاوي اسيد تري­كلرواستيك w/v) 20%) است، اضافه گردید.

5.  مخلوط در حمام آب داغ به دماي C° 95 به مدت  30 دقيقه حرارت داده شد.

6. به منظور توقف واكنش، ظرف محتوي مخلوط حرارت داده شده به سرعت درون حمام يخ قرار داده و اجازه داده شد به مدت30 دقيقه در حمام يخ بماند. بایدتوجه داشت كه زمان حرارت دادن بسيار مهم است وبه هيچ عنوان نبايد از 30 دقيقه بيشتر يا كمتر شود.

7.  مخلوط سرد شده با دور rpm 10000 به مدت 10 دقيقه سانتريفوژ گردید.

 ميزان جذب مخلوط  به وسيله دستگاه اسپكتروفتومتر UV-VIS در دو طول موج nm 532 و nm 600 اندازه گيري شد. ( جذب در طول موج دوم غير خالص است كه بايد از جذب در طول موج اول كم شود و در محاسبه مقدار MDA ضريب خاموشي mM-1cm-1  155 نيز لحاظ گردید).

مثال:

Abs 532 = 0.5180

Abs 600 = 0.1224

600 – 532 = OD

OD . 155 =  MDA

MDA = مقدار جذب  . 155

OD = 0.3956

0.3956 . 155 =  61.318 

61.318 : 0.52 = A

A . 5 ml

A = 589.59   mM  MDA

منابع:

حسیبی، پیمان. 1386. بررسی فیزیولوژیکی اثر تنش سرما در مرحله گیاهچه ای ژنوتیپ های مختلف برنج. رساله دکتری تخصصی. دانشگاه شهید چمران اهواز. 145 صفحه.

Davey M.W, Stals E, Panis B, Keulemans J, Swennen R.L. 2005. High throughput of malondialdehyde in plant tissues. Analytical Biochemistry. 347 : 201-207.

Stewart R. C, Beweley J.D. 1980. Lipid peroxidation associated with accelerated aging of soybean axes. Plant Physiology. 65:245-248.